bac 载体_BAC载体_1

bac 载体_BAC载体

       谢谢大家给我提供关于bac 载体的问题集合。我将从不同的角度回答每个问题，并提供一些相关资源和参考资料，以便大家进一步学习和了解。

1.bac ????

2.质粒的构建过程

3.E.coli DH10 Bac与DH5α有什么区别

4.什么是BAC序列?

5.什么是BAC 末端测序？有关DNA测序的方面

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       粉末活性炭在MBFB工艺中可以重复使用

       在MBFB反应系统中，粉末活性碳(PAC)由于吸附大量微生物，成为生物活性碳（BAC）,使PAC不仅存在着对小分子有机污染物的吸附和富集作用，还存在着PAC对微生物的吸附和保护作用、PAC对溶解氧的吸附作用、在局部高污染物浓度和高溶解氧条件下微生物对小分子有机物的分解作用以及PAC的生物再生作用。PAC、微生物、溶解氧、污染物等要素在高强度流化、混合、传质、剪切作用下，实现对微污染小分子有机物的高效分解。

       　1、PAC对小分子有机物的吸附和富集作用PAC能富集污染物形成局部高浓度区，有利于微生物生长和对微污染小分子有机物的分解作用；

       　2、PAC对微生物的吸附和保护作用；

       　3、PAC对溶解氧吸附作用，随着活性炭颗粒直径变小，比表面积增加，PAC对溶解氧的吸附作用越来越强；

        4、微生物对小分子有机物的分解作用，MBFB工艺通过PAC对微生物、污染物和溶解氧的吸附和富集作用；通过PAC对微生物的保护作用，使微生物能有效利用微量的有机污染物为底物，以溶解氧为电子受体，分解微污染水体中有机物，实现水质深度净化；

       　5、PAC的生物再生作用，活性炭表面生物膜对吸附的有机物具有氧化分解作用，可通过生物降解恢复活性炭吸附能力，实现PAC的生物再生，在MBFB系统中，高强度的三相传质、混合、紊流、剪切和活性炭颗粒之间的摩擦作用，使活性炭表面老化生物膜不断脱落，使MBFB保持高效的吸附和生物降解功能。

质粒的构建过程

        2002年KurofwaY构建成功的转染色体牛，也是在利用构建人人工染色体技术形成的，HAC外周血淋巴细胞中的存留率为91%，远远高于HAC在鼠体内的存留率。

       在1995年已利用STS构建了225个酵母人工染色体（YAC）连续克隆重叠群组成的、覆盖范围达整个人类基因组75%的第一代物理图谱。

       因此到了1992年，Shizuya等发展了细菌人工染色体(BAC)作为构建基因组文库的载体，BAC质粒以大肠杆菌为宿主，克服了YAC载体的不足之处，同时BAC质粒外源插入片段可达150kb上，能满足物理图谱的构建、染色体的步查等基因组的研究，因而逐渐取代YAC载体成为基因组文库构建的首选载体。

       1992年底，陈竺赴法国巴黎人类多态性研究中心拷贝酵母人工染色体基因文库（YAC文库）这是该中心在1992年人类基因组国际会议上宣布赠送给上海第二医科大学陈竺领衔的血液分子生物学实验室的，至此，中国成为世界上第四个拥有此国际最先进基因库的国家。 1990年，科学家研究出细菌人工染色体；1990年，在人类基因组工程启动的同时，研究人员也开始研究如何制造高效稳定的大分子DNA载体—细菌人工染色体（BAC）载体。

       1987年，Burke和lson以自主复制序列(ARS)着丝点序列(CEN)和端粒序列(TEL)为基础，加入可在大肠杆菌中行使功能的复制起点(ORI)以及在酵母细胞中的选择标记，成功地构建了酵母人工染色体(YAC)并以此作为克隆运载体与高分子量外源DNA连接，转化酵母细胞。

       随着1983年Murray等将酵母菌染色体着丝粒、自主复制序列和端粒连接在一个载体上，构建了第一个酵母人工染色体(YAC)美国华盛顿大学Burke等构建了一个YAC载体，首次将人的DNA大片段插入YAc载体，并导入宿主菌一酵母菌，才使构建覆盖基因组的物理图谱和图位克隆基因成为可能。

       自1983年由Murray等人首次成功构建了酵母人工染色体(YAC)以来，人工染色体的研究受到科学家们的广泛关注，并取得迅速发展，人工染色体在基因组分析，基因功能鉴定，基因治疗及染色体结构与功能关系的研究等方面具有重要意义。 1983年。酵母人工染色体构建成功，14年后，第一个HAC的成功构建，被认为是基因治疗载体研究领域的重大突破。1980年，李炳林教授等用亚洲棉与比克氏棉进行杂交，得到异源二倍体杂种，经人工染色体加倍，获得可育的异源四倍体。

       1974年所得214株绿色小苗，大多数生长健壮，经人工染色体加倍处理后，移栽于温室中，进行管理和观察，现生长良好，有18个株系已开花结实，已得种子近136粒。

       1973年所得39株绿苗，有37株栽培长大，其中32株经人工染色体加倍处理后，有6株正常结实，共收获种子37粒，现已再次播种繁殖。

E.coli DH10 Bac与DH5α有什么区别

       因为高拷贝质粒稳定性低，而且给宿主细胞的压力大。

       低拷贝数的质粒DNA在宿主细胞分裂前只能复制1～2次，而多拷贝数质粒可以在细胞分裂前复制成10～200拷贝。

       高拷贝数的质粒称为松弛型质粒(relaxed plasmid)，独立于细菌细胞而自主复制；低拷贝数的质粒一般是严紧型质粒(stringent plasmid)，它们的复制随细菌染色体的复制同步进行。

       一般来说，外源基因的表达量随拷贝数的增加而提高，但是当拷贝数很大时，拷贝数与发酵目标产物产率的这种关系却不存在。这主要有两方面的原因：一方面，高拷贝数时外源基因的表达量不再由质粒的拷贝数决定，可能是由转录和翻译水平决定的；另一方面，高拷贝数的质粒往往很不稳定。由于质粒拷贝数的变化直接与基因目标产物的产率有关，因此对于重组蛋白的生产来说，质粒的拷贝数是一个非常重要的参数。

       而且同一个细胞里一般不会同时有两种不同的质粒，这是质粒不相容性(plasmid incompatibility)。在细菌细胞增殖过程中，其中必有一种会被逐渐排斥。所以要用纯化过的低拷贝质粒。

       低拷贝在鸟枪法测序中很常用的。

       随机测序战略又称鸟枪战略(shotgun strategy),此策略是将人 类基因组DNA用机械方法随机切割成2Kb左右的小片段,把这些DNA片段装入适当载体,建 立亚克隆文库,从中随机挑 取克隆片段.最后通过克隆片段的重叠组装确定大片段DNA序列.?

       1991年,Hunkapiller T等首先应用鸟枪策略分析了小鼠T细胞受体和靶位的94.6kb基因组. 19 95年,美国私立基因组研究所(TIGR)所长Venter JC率先应用鸟枪策略对微生物基因组测 序 并取得了成功.同年完成的流感嗜血杆菌的序列测定完全是用shotgun策略直接进行的.该实验充分证明了此策略是分析微 生物基因组全序列的有效策略之一.从1998年起,Venter领导的研究小组对人类全基因组采用鸟枪 战 略测序DNA提出大胆构想,计划在三个层次上进行测序,即对每一层次克隆的两端的称为序 列标签联结子(STC)的500bp进行测序.第一个层次用BAC做载体,插入片段为150kb,并计划 构建30万个BAC克隆,对每个BAC两端的500bp直接测序,获得10%的人类基因组序列,平均每 5kb就有一个500bp序列标记.第二层次是用低拷贝质粒作载体,插入10kb片段,构建500万 个克隆,对克隆两端的500bp测序,得到50亿个碱基序列.第三层次是用多拷贝质粒作载体 ,插入2kb片段,计划构建3000万个克隆,再对每个克隆的500个碱基直接测序,可获得300 亿个碱基序列

什么是BAC序列?

       DH5α是最最常用的质粒克隆的菌株。

       DH5α在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补。可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。

       菌株中很多重组酶、修饰酶等缺失，防止质粒的重组、修饰，能够保持携带质粒的稳定性。

       本底蛋白表达较低，便于提取高纯度质粒。

       一般常用于质粒的构建、扩增，较少用于蛋白表达。

       DH10 Bac是一种比较特殊的感受态细胞，在昆虫-杆状病毒真核表达系统专门用于生产重组杆状病毒。细胞内含有Bacmid和辅助质粒。

       连有目的基因的pfastBac系列载体转入细胞后，会在helper的帮助下与Bacmid发生重组，产生重组杆状病毒，提取出来后可直接用于昆虫细胞的转染。生产目的蛋白。

什么是BAC 末端测序？有关DNA测序的方面

       中文名称：细菌人工染色体

       英文名称：bacterial artificial chromosome;

       BAC 定义：利用大肠杆菌F质粒或P1噬菌体为基础构建的用于在大肠杆菌中克隆大片段DNA(100～300 kb)的载体。用于基因组结构的分析。

       BAC是细菌人工染色体意思，之所以有BAC文库的出现，是因为基因组序列太长，测序，以及筛选基因等没有办法完成，所以将基因组片段随机打断成片段，连到载体上构建成一系列的重组子，这样当你需要特定的序列，只需要筛选出自己要的那个bac重组子就行了。说的有点过于简单，不知道你能明白否？末端测序也是采用的双脱氧终止法的。双脱氧终止法的原理是；碱基之间是通过俩个碱基的5‘磷酸基团和3’羟基连接的，双脱氧终止法就是利用了这个3‘羟基，将3’羟基脱氧变成氢键，那么这样下一个碱基的5‘磷酸基团就没有办法连到前一个碱基上了。所以如果在做测序pcr的时候加一部分正常的dNTP(3号位为羟基),加一定量的ddNTP(2,3号位都是氢键)，那么在第一个碱基后如果接上去的是dNTP,那么就可以接着连第三个碱基，如果连得是ddNTP,那么就没有办法连下个碱基形成链终止，在测序pcr中，数以万计的反应，那么就会出现2个碱基后终止的链，也有可能出现3个，4个，N个碱基后终止的链，这样就形成了一系列从一个碱基到N个碱基的序列（其最后一个碱基都是三号位为氢键的，这个应该理解吧）。那么如果我们在连上去的ddNTP上连上个荧光基团(四种ddNTP连上不同的荧光基团)，那么将这一系列长度的链跑胶，会形成一系列的带，通过每条带最后一个碱基的荧光通过机器就能够区分是什么碱基，将这些碱基拼接好后就是你要的序列了。

       好了，今天关于“bac 载体”的话题就到这里了。希望大家能够通过我的讲解对“bac 载体”有更全面、深入的了解，并且能够在今后的生活中更好地运用所学知识。